コンビネーションスクリーニング法

コンビネーションスクリーニング法とは？

コンビネーションスクリーニング法は、大腸菌ディスプレイ法と抗体ダイレクトクローニング法を組み合わせた、新しい抗体スクリーニング法です。「大腸菌ディスプレイ法」を用いて、抗体を大腸菌表面にディスプレイする大規模な抗体ライブラリー（10⁹以上）を構築し、陽性クローンを選抜し、ライブラリーを濃縮します。続けて「抗体ダイレクトクローニング法」を実施することにより、大規模なLibraryからSpeedyに陽性クローンを確実に同定することが可能になりました。

「大腸菌ディスプレイ法」では、抗体を大腸菌外膜タンパク質と融合させ、大腸菌外膜表面に発現した後、抗原に結合する抗体を発現している大腸菌を選抜します。「抗体ダイレクトクローニング法」は、大腸菌ディスプレイ法にて陽性クローンを濃縮したライブラリーを、抗原固相化メンブレンおよびコロニー形成用フィルターを配置したフィルターサンドイッチ上に播種し、コロニーを形成させます。抗体発現を誘導し、発現された抗体が分泌され、親水性フィルターを通り抜け、メンブレン上の抗原に補足されます。この抗原結合抗体を検出することにより、抗原結合活性をもつ抗体を産生するコロニーを同定します。「抗体ダイレクトクローニング法」では、抗原抗体結合を直接検出することで陽性クローンを選抜するので、偽陽性なく、確実に陽性クローンを同定することが可能です。

コンビネーションスクリーニング法は、ナイーブライブラリーの様に大きなライブラリーから少ない候補抗体の選択や、免疫ライブラリーからより多くの候補抗体を取得する目的に適したスクリーニング技術です。

コンビネーションスクリーニングのブレイクスルー

バイオピークでは最初に、偽陽性が少なく迅速に目的抗体を発現する陽性クローンを同定できる、抗体ダイレクトクローニング法の開発に成功しました。この方法は、免疫ライブラリーからは、素早く多数の抗体を得ることができることが利点ですが、ラボレベルではスクリーニングできるライブラリーの規模が10⁵以下程度であり、ナイーブライブラリーなどターゲットの存在確率の低いライブラリーから抗体を選択するには難点がありました。一方、ディスプレイ法には、大きなライブラリーを扱える利点がありますが、抗原と結合する抗体を発現するクローンを同定しようとする場合、多大な労力と長い時間が必要となるという問題があります。そこで、とディスプレイ法と抗体ダイレクトクローニング法を組み合わせることで、大規模なライブラリーから陽性クローンを濃縮し、濃縮したライブラリーから素早く陽性クローンを同定できるのではないかと、開発が始まりました。

2つのスクリーニングを組み合わせたコンビネーションスクリーニングを実現するために、大腸菌に抗体を提示させる必要がありました。そこで、様々な外膜タンパク質の中から、スクリーニングに適した候補を選択し、確実に抗原を提示する発現ベクターの開発や、最適なホストの選択を行い、「大腸菌ディスプレイ法」を開発しました。しかし、抗体の発現様式が、大腸菌ディスプレイ法では表面提示、抗体ダイレクトクローニング法では細胞外への分泌と、両者では異なりました。この2つを組み合わせるためには、ベクターの乗せ換えが必要となり、時間と手間がかかり、なおかつ、ライブラリーの多様性を損ない、陽性クローンを失う危険性がありました。そこで、バイオピークではグラム陰性菌が放出するOMV(Outer Membrane Vesicle)に注目し、抗体をディスプレイした大腸菌を用いてそのまま抗体ダイレクトクローニング法を行うことに成功しました。